Swissuniversities (https://www.swissuniversities.ch)

Daniel Sojka (Biologické centrum AV ČR, v. v. i.)

97 697,49 CHF

University of Geneva
Faculty of Medicine

• Pomocí rekombinantní techniky genového cílení (knock-in) jsme sestavili T. gondii řadu vyjadřující C-terminál -Ty epitop tag z endogenního TgASP5 locus. Klonovaná řada byla ověřena jak PCR se specifickými primery a analýzou technikou Western blot pomocí anti-Ty monoklonálních protilátek. 
• Na rozdíl od plazmepsinu V nacházejícího se v endoplazmatickém retikulu TgASP5 se omezuje konkrétně na Golgi tak, jak je zobrazeno štítkováním IF fúzního proteinu knocked-in C terminálu-Ty TgASP5 spoluvyjadřující poškození T. gondii Golgi marker-YFP (Golgi opětovné sestavení a hromadící se protein, GRASP; žlutý fluorescentní protein, YFP)
• Rovněž jsme využili TgASP5 genovou knock-in strategii k přerušení čtecího rámce endogenního TgASP5 locus se seříznutou N terminální částí TgASP5 (kromě míst aktivní peptidázy) a C terminálně označené pomocí Ty (Knock-in/Knock-out). Transformované parazity neprojevily téměř žádnou schopnost přežít pod výběrem a nebyl zjištěn žádný signál z opakovaných IFA. To indikovalo velmi důležitou roli TgASP5.
• Poněvadž přístup RNAi se zdá být ještě ve svém počátečním stádiu a nemohl by se důvěryhodně použít k vyhodnocení T. gondii genových/proteinových funkcí5, pro haploidní asexuální parazitní stádia, pokud příslušný gen plní velmi důležitou úlohu pro přežití, podmíněný genový knock-down je optimální strategií k dosažení transgenických rodů. To hlavně zahrnuje expresi příslušného genu z promotéru kontrolovaného tetracyklinovým operonem, zavedení destabilizační domény (DD) nebo využití Cre-lox recombinázového technologického systému specifického pro místo zavedením dvou nezávislých míst Lox P v příslušném locusu Cre rekombinázy vyjadřující buněčnou linii parazitů. Navrhli jsme pět různých přístupů založených na výše uvedených opcích pro TgASP5. Byly většinou zkonstruovány plazmidy, u parazitů v současné době probíhá transfekce a parazity byly vybrány pro pozitivní klony. Ukázalo se, že (Tet)-založená přepisovací regulace druhé kopie TgASP5 pod stabilním promotérem exprese pracuje efektivně, a tak zůstává naším preferovaným přístupem k dosažení TgASP5 podmíněných knock-downs.
• T. gondii parazitní klon vyjadřující TgASP5 s C-terminál -Ty epitop tagem se v současné době používá pro metabolické techniky štítkování. Celkovým cílem je získat imunosražený nativní enzym používající anti-TY monoklonální protilátky. Stržený TgASP5 by měl být testován na aktivitu štítkováním příbuznosti (afinity) se sondou FAP-09 založenou na aktivitě v přítomnosti/nepřítomnosti katepsin D inhibitor pepstatinu A a testy s fluorescentně štítkovanými peptidylovými substráty, jako např. Abz- KPAEFFRL.
• Paralelně rekombinantně vyjádřený 6x histidin označený E. coli TgASP5 fragment (s výjimkou C-terminál transmembránové domény) se připravuje a bude použit k získání TgASP5 polyklonálních králičích protilátek a testován na aktivitu s katepsin-D specifickou sondou založenou na činnosti FAP-09 a substrátem Abz-KPAEFFRL.
• Publikace: Hammoudi P.M., Jacot D., Mueller C., Di Cristina M., Dogga S.K., Marq J.B., Romano J., Tosetti N., Dubrot J., Emre Y., Lunghi M., Coppens I., Yamamoto M., Sojka D., Pino P., Soldati-Favre D. (2015) Fundamental Roles of the Golgi-Associated Toxoplasma Aspartyl Protease, ASP5, at the Host-Parasite Interface PLoS Pathogens 11: e1005211.

Babesióza je nová nemoc přenášená klíšťaty a podobná malárii, která ohrožuje více než polovinu světové populace dobytka a její závažné případy u lidí se pravidelně vyskytují v populacích s oslabenou imunitou. Kauzativní činitelé Babesia sp. patří do velké skupiny apikomplexanových parazitů a jsou spojeny s malarickými druhy plasmodií, které jsou intenzivně studovány. Cílem tohoto projektu je využít “nejmodernější” protokoly ke studiu endocytózy a proteolytické degradace v rámci hlavních apikomplexanových modelů ve švýcarské instituci. Vyžaduje se objasnění molekulárních mechanismů implikovaných v přenosu a prudké nakažlivosti s cílem lépe chápat interakce hostitelského patogenu a hostitelského vektoru a navrhnout nové specifické léky a vakcíny pro toto onemocnění. Na základě předchozích zkušeností stážisty navrhujeme prozkoumat funkce aspartové proteázy skupiny/klanu C z plazmodia (PfPMIX a PfPMX) a toxoplazmy (TgASP3). Tyto proteázy již byly charakterizovány ve švýcarské instituci. Cílem je určit specifickou funkci každé proteázy aplikující obrácené genetické přístupy v toxoplazmě gondii a případně plazmodii berghei. Tyto geny byly extenzivně zkoumány ve švýcarské laboratoři a zdají se být důležitými a budou aplikovány podmíněné knock-down strategie. Lokalizace a dynamika těchto proteáz během lytického cyklu těchto parazitů bude zkoumána konfokální mikroskopií. Paralelně budou tyto enzymy rekombinantně vyjádřeny a očištěny s cílem definovat enzymatické vlastnosti, aktivační podmínky a substrátovou specifičnost. Řešení 3D struktury proteinovou krystalizací bude považováno za společné úsilí. Technologie pak budou přeneseny do vysílající laboratoře a po návratu do vysílající instituce budou aplikovány na výzkumné zájmy týkající se prvoku Babesia.